康普森小課堂 | 聊一聊酵母雙雜交技術

來源: 發表日期:2018-09-25 瀏覽量:1016

蛋白質是基因表達的產物,其存在方式直接與生物功能相關,所以研究蛋白質之間的相互作用是非常必要的。蛋白質相互作用的研究方法包括酵母雙雜交技術、pull down實驗、免疫共沉淀、熒光共振轉移技術等等。酵母雙雜交技術簡便、靈敏、高效,在蛋白互作的研究中得到了廣泛的應用。

今天跟隨小編一起來了解一下酵母雙雜交技術吧。

蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎,研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調控影響的實驗,它是由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立。轉錄活化蛋白可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄反應,這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄活化蛋白上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(Binding Domain, BD)和轉錄活化結構域(Activation Domain, AD)分別來完成的。BD可識別DNA上的特異序列, 并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游, AD可同轉錄復合體的其他成分作用,啟動它所調節的基因的轉錄。二者對于基因的轉錄活化都是必須的。


轉錄因子活化示意圖(以GAL4蛋白為例)


在利用GAL4系統篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時,DNA結合結構域與靶蛋白即“誘餌”相結合,轉錄活化結構域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結合。在BD與AD要導入的酵母菌AH109中,通過基因工程的方法在GAL4啟動子上游激活序列(UASs)和啟動子的下游構建了3個報道基因——ADE2、HIS3、MEL1(或LacZ),因此可以通過營養缺陷篩選和酵母菌表型的改變來篩選或驗證兩個蛋白之間是否存在相互作用。


酵母雙雜交系統的原理圖

酵母雙雜交系統特點與優勢

1. 融合體蛋白之間的互作在真核酵母細胞內進行,蛋白質保持天然的折疊狀態,更接近于體內的真實水平。

2. 雙雜交系統的敏感度非常高,蛋白互作易被檢測到。

3. 在篩選文庫時,雙雜交系統能夠得到編碼互作蛋白的基因序列,省略了其它體外檢測蛋白互作方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。


酵母雙雜交技術的應用


正如基因組研究計劃曾給科研工作者以巨大希望一樣,利用酵母雙雜交技術去探索紛繁復雜的蛋白質之間的聯系,為我們獲得越來越多的未知生物學信息提供了可能性。



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